人眼瞼真皮成纖維細胞永生化是通過原代細胞人眼瞼真皮成纖維細胞分離培養SV40過表達慢病毒轉染構建擴增至少到12代而成的。

1.試驗所需儀器設備及試劑

（1）儀器

（2）試劑耗材

2.人真皮成纖維細胞（A）的分離培養

1) 將手術中取出的組織置于無菌PBS緩沖液中低溫運輸，

2) 在超凈工作臺內取出組織，用75%酒精浸泡2min左右，置于含有P/S的PBS中，

3) 將組織塊剪成邊長約為0.1cm的正方形，反復清洗后棄上清，置于含有wan全培養基的培養皿中，37℃孵育30~60min，

4) 用鑷子夾入培養瓶中，倒置于5%CO2培養箱中孵育2h，

5) 分別加入2ml成纖維細胞wan全培養基，浸潤組織塊，但不能使組織塊漂浮，置于5% CO2細胞培養箱中，

6) 每隔3天換液，待組織塊周圍生長的細胞融合成片，即可去除組織塊， 用胰蛋白酶消化細胞，重新鋪瓶。

細胞培養圖片如下：

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原圖見文件-細胞培養

3．免疫熒光鑒定

3.1實驗步驟

（1）細胞爬片

取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培養基1mL，加入細胞0.02million個/孔。置培養箱2h或過夜。

（2）固定

細胞爬片后，吸出培養基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃過夜。

（3）破膜封閉

將玻片除去水分，置于培養皿支撐物上，

玻璃片封閉液配置：0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合，再加10% 血清，

取50uL破膜封閉液滴于防水膜上，將玻片上有細胞的一面蓋上2h。

（4）一抗孵育

一抗配制：抗體與PBS 1:100（200）稀釋

破膜封閉后，取50uL一抗于防水膜上（濕盒中），將玻片（有細胞的一面）蓋上置于4℃（最多可放置一周）

（5）二抗孵育

室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。

（6）包埋

玻片上各滴1滴Fluoromount-G，將有細胞的一面蓋上。

鑒定細胞為P1代細胞

3.2免疫熒光鑒定結果

              100X-DAPI                                     100X-fluorescence

                200X-DAPI                                 200X-fluorescence

原圖見文件-免疫熒光

4.轉染

4.1SV40過表達慢病毒基本信息

4.2轉染

（1）將細胞接種6孔板，每孔細胞數約為1×10^5 個，

（2）第二天，待細胞貼壁后，換液，

（3）加入1mLwan全培養基，再加20 μL SV40過表達慢病毒，

（4）混勻后繼續培養，

（5）12h后觀察細胞狀態，并更換為新鮮培養基，

（6）當細胞長滿板底后，傳代至T25培養瓶中。

5.篩選

5.1殺滅曲線的確定

（1）將未轉染的細胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜，

（2）第二天，除去24孔板中舊的培養基，

（3）將含不同濃度嘌呤霉素（1ug/mL，2ug/mL，3ug/mL，4ug/mL，5 ug/mL，6ug/mL，7ug/mL）的新鮮培養基加入已鋪有細胞的24孔板，

（4）每2天更換新鮮的篩選培養基，

（5）每天觀察細胞的存活比例，

（6）最小的嘌呤霉素使用濃度就是從嘌呤霉素篩選開始1-4d內殺死所有細胞的zui低篩選濃度。

結果：嘌呤霉素的使用濃度為3ug/mL，作用時間2d。

5.2嘌呤霉素篩選轉染細胞

（1）第一天，將轉染的細胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜

（2）第二天，除去24孔板中舊的培養基，

（3）加入含嘌呤霉素（3ug/mL）的篩選培養基，孵育，

（4）每2天更換新鮮的篩選培養基，

（5）每天觀察細胞的存活比例，

（6）在同一時間點（2d）存活的細胞，即為轉染成功的細胞，

（7）對篩選后的細胞進行擴增。

6.細胞擴增

將篩選后的細胞進行擴增，篩選后的細胞為P1代，擴增至少到12代。

永生化的細胞圖片如下：

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原圖見文件-永生化